ELISA原理

2020/10/24 admin 17

了解ELISA的所有基本原理,并确定这是否适合您的实验。

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图1. ELISA分析的基本设置。多孔板上的捕获抗体将固定目标抗原。该抗原将被与生物素和抗生蛋白链菌素-HRP偶联的检测抗体识别并结合。 

ELISA代表酶联免疫吸附测定,通常也称为酶免疫测定(EIA)。像其他类型的免疫测定法一样,ELISA依靠抗体使用高度特异性的抗体-抗原相互作用来检测目标抗原。

在ELISA分析中,必须将抗原固定在固体表面上。这可以直接完成,也可以通过使用固定在表面的捕获抗体本身来完成。然后将抗原复合至与抗体结合的检测抗体,所述分子适合于检测,例如酶或荧光团。

ELISA分析通常在多孔板(96或384孔)中进行。多孔板提供固定抗原的固体表面。分析物的固定有助于抗原与样品中其余成分的分离。这种特性使ELISA成为同时对多个样品进行分析的最简便的方法之一。

ELISA的优缺点

好处缺点
高灵敏度和特异性:由于使用抗体,ELISA通常以非常特异的方式在皮克级检测抗原。临时读数:检测基于酶/底物反应,因此必须在短时间内获得读数。
高通量:商业ELISA试剂盒通常以96孔板形式提供。但是该测定法很容易适用于384孔板。有限的抗原信息:仅限于样品中抗原的数量或存在的信息。
易于执行:协议易于遵循且几乎不需要动手时间。
定量的:它可以确定样品中抗原的浓度。
可以测试各种样品类型:血清,血浆,细胞和组织提取物,尿液和唾液等。

这些是一般ELISA的优缺点。

ELISA的类型,包括直接,间接,夹心法和竞争性ELISA。 


直接ELISA

抗原被固定在多孔板的表面,并用对该抗原具有特异性的抗体检测,并直接与HRP或其他检测分子偶联。 


间接ELISA
类似的直接ELISA测定中,抗原被固定到多孔板的表面上。然而,检测需要两步过程,由此对抗原具有特异性的一抗结合至靶标,并且针对一抗的宿主物种的标记二抗与一抗结合以进行检测。
该方法还可用于通过用血清代替一抗来检测血清样品中的特异性抗体。


夹心ELISA

夹心ELISA(或夹心免疫测定)是最常用的形式。这种格式需要两种针对抗原不同表位的特异性抗体。这两种抗体通常称为匹配抗体对。一种抗体包被在多孔板的表面上,并用作捕获抗体以促进抗原的固定。另一抗体被缀合并促进抗原的检测。


竞争性ELISA
也称为抑制ELISA或竞争性免疫测定,该测定法测量由检测信号干扰的抗原的浓度。先前的每种格式都可以适应竞争性格式。样品抗原与参考抗原竞争结合特定量的标记抗体。将参考抗原预先包被在多孔板上。将样品与标记的抗体预孵育,然后添加到孔中。根据样品中抗原的数量,或多或少的游离抗体可用于结合参考抗原。这意味着样品中存在的抗原越多,将检测到的参考抗原越少,信号越弱。
一些竞争性ELISA试剂盒使用标记的抗原代替标记的抗体。标记的抗原和样品抗原(未标记)竞争与一抗的结合。样品中抗原的含量越低,由于孔中标记的抗原越多,信号越强。