等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)
等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。常见的等温扩增技术有以下几种:
loop-mediated isothermal amplification , LAMP是2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物,利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30-60分钟,即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比,不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP 是一种全新的核酸扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点。
* 滚环扩增技术 RCA
滚环扩增技术(RCA)是近年来发展起来的一种新型的核酸扩增技术。该技术是基于连接酶连接、引物延伸、与链置换扩增反应的一种等温核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型探针互补的重复序列。与传统的核酸扩增方法相比,它具有扩增条件简单,特异性高,能在恒温条件下进行等特点。滚环扩增技术结合荧光、电化学、电化学发光等检测技术可以实现高灵敏的生物分子检测。
* 单引物等温扩增 SPIA
同一温度(42℃),在MMLV酶与一条引物的相互作用下,首先合成模板的互补DNA单链,互补DNA单链自身成环形成钥匙结构,并在MMLV酶的作用下形成T7 RNA聚合酶的启动子识别区域,T7 RNA聚合酶识别转录出多个RNA拷贝。每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环;同时,带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合,产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获,直观反映扩增循环情况。
* 依赖解旋酶的等温扩增技术 HDA
依赖解旋酶DNA 恒温扩增技术( Helicase-dependent Isothermal DNA Amplification, HDA)是由美国NEB公司研究人员V incent等于2004年发明的一种新型核酸恒温扩增技术。该技术模拟自然界生物体内DNA 复制的自然过程, 在恒温条件下利用解旋酶解开DNA双链, 同时DNA单链结合蛋白( single- stranded DNA - binding protein, SSB )稳定解开的单链, 并为引物提供结合模板, 然后由DNA 聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又解成单链, 并作为下一轮合成的模板进入上述的循环扩增反应, 最终实现靶序列的指数式增长。
* 链替代扩增 SDA
链置换扩增术(strand displacement amplification,SDA)是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列,核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口,DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行,使靶序列被高效扩增。
其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。
* 交叉引物扩增技术 CPA
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)
1.LAMP引物的设计
2.扩增原理
3 LAMP的特点
的时间损失.核酸扩增在l
h内均可完成,添加环状引物后时间可以节省1/2,多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍,达0.5
mg/mL.应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
4 引物设计实例
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程:
在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑:
1.引物之间的距离
F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。
F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。
F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。
2.引物的Trn值
引物的Tm值采用近邻分析法(the
nearest-neighbor method)来计算,这种方法是目前认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt
concentration),寡核苷酸的浓度等实验条件的影响,所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
例如:寡核苷酸的浓度为0.1µmol,钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4
mM等。
Tm(退火温度=△h*1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+]
式中,Tm为退火温度,℃;为摩尔气体常数,1. 987ca1/℃•rnol ; △H为焓变;△s
为熵变;C为寡聚核苷酸的浓度;[Na+]为钠离子浓度。
对于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值为60~65℃,而对于AT富集的引物Tm值为}55~60℃。在设计引物的时候,F1c和B1c的Tm值大概是65℃(64~66℃),
F2,B2,
B31的Tm值大概是60℃(59~61℃)。
3.引物末端的稳定性
引物的末端作为DNA合成的起点必须有一定的稳定性,自由能改变值(△G)是指反应物的自由能与产物的自由能之差,反应朝着自由能减小的方向运行口引物和目的基因之间的退火反应是一个动态平衡的反应,自由能改变值(△G)越小,引物与模板之间的退火反应越容易发生。
一般在进行引物设计的时候,F2/B2F3/B3的3’端和F1
c/B1c的5’端的自由能改变值小于或等于-4Kcal/mol。F1C的5’端扩增以后相当于F1的3’端,所以它的稳定性很重要。
4
GC含量
引物在设计的时候使其GC含量介于40%~65%之间,但是当引物的GC含量介于50%~60%时,引物的质量相对好一些。
5.二级结构
引物在设计的时候要防止形成二级结构,这一点是十分重要的,特别是内引物。
说明:本文内容来源网络,仅供参考。