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共聚焦荧光探针标记方法

2016/01/02 华泰昕生物|HyperCyte 已读

(一)BCECF测定pH值

1. 储存液配制 BCECF-AM溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,-20℃避光保存。

2. 染色步骤将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入BCECF-AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(二)SNARF-1定量比率测定pH值

1. 储存液配制 SNARF溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,-20℃避光保存。

2.染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入SNARF-1-AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(三)Indo-1测定细胞内Ca2+

1. 储存液配制 Indo-1(分子量为840),活细胞标记常选用Indo-1AM,分子量为1010,呈干粉状,将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,避光冷藏保存。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入Indo-1AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

也可用弱的去垢剂Pluronic F-127助染。可将PluronicF-127溶于DMSO配成20%(W/V)的溶液,终浓度1%~2%。

(四)Fluo-3测定细胞内Ca2+

1. 储存液配制 Fluo-3(分子量为855),活细胞标记常选用Fluo-3AM,分子量为1130,呈橙色粉状,避光冷藏保存或将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,避光冷藏。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入Fluo-3AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

可用Pluronic F-127助染。方法同上。

(五)CFDA测定细胞间通讯

1.储存液配制CFDA即5-(6)-羧基荧光黄乙酰乙酸盐(5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate,5(6)-CFDA),分子量为460.40,用乙醇或DMSO配成10mg/ml溶液,等份分装后,避光冷藏。

2. 染色步骤将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入CFDA溶液(终浓度10-20ug/ml),37℃孵育10~15min。用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(六)DiBAC4测定细胞膜电位染色步骤

1. 培养细胞用DiBAC4孵育,37℃,10~20min,终浓度2~5μmol/L。

2.激光扫描共聚焦显微镜观察,实验中注意将细胞内外的DiBAC4浓度保持一致。如果细胞去极化,如增加溶液的KCl浓度10~15μmol/L,DiBAC4荧光强度增强。

(七)Rhodamine 123标记活细胞线粒体染色步骤

培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍加入Rhodamine123溶液(终浓度1μg/ml),37℃孵育10~30min用PBS冲洗2遍激光扫描共聚焦显微镜观察。

(八)AO显示RNA和DNA染色步骤

培养细胞用95%酒精固定10~15min,干燥。1%醋酸酸化30s。0.01%AO染色5~10min。PBS(pH4.8)洗1min。0.1mol/L CaCl2分化30s或用水洗数分钟。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(九)PI显示DNA染色步骤

培养细胞用PBS洗2遍,离心。弃上清液留0.5ml,用PBS将细胞密度调整为1×106/ml。加入浓度为5mg/50ml的RNAase 0.5ml,37℃消化30min。取出放入冰浴中,加入浓度为5mg/100ml的PI 1.5ml , 染色至少30min。300目尼龙网过滤。共聚焦显微镜观察。

来源网络,仅供参考。