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RNA干扰技术简介

2015/12/10 华泰昕生物|HyperCyte 已读

RNA干扰的原理

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。近几年来RNAi研究取得了突破性进展,被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
1995年,Guo等发现注射正义RNA(sense RNA)和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达,该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。1998年,Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发,并证实这种抑制主要作用于转录之后,所以又称RNAi为转录后基因沉默( posttranscriptional gene silencing ,PTGS) 。随后人们陆续在果蝇(Drosophila) 、锥虫( Trypanosomes) 、涡虫( Planaria) 、斑马鱼( Zebrafish) 、拟南芥(Arabidopsis thaliana) 、大小鼠和人体内发现了RNAi 现象, 并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。研究表明RNAi 是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制, 与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关。通过对RNAi 现象的遗传学与生物化学研究,其作用机制已日渐清晰(见图1) 。现有实验资料提示, 外源的或体内产生的长双链RNA(long double stranded RNA, dsRNA) 首先被降解为长21~23bp 的小分子双链RNA , 这种RNA 分子称为小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA) , siRNA 通过碱基互补配对识别具同源序列的mRNA , 并介导其降解。在RNAi 过程中一种称为Dicer 的核酸酶负责将dsRNA 转化为siRNA 。siRNA 形成之后, 与一系列特异性蛋白结合形成siRNA 诱导干扰复合体( siRNA induced interference complex , RISC) , 此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA 并使其降解, 从而导致特定基因沉默。
RNAi 效应具有两个明显的特征, 特异性和高效性。干扰的高效性提示在机制中存在信号放大的步骤。Fire 等早在1998 年便发现少量的dsRNA就能够导致线虫大量的靶mRNA 降解, 但单凭少量dsRNA 被Dicer 降解为几十个siRNA 并不能解释这种高效性。许多研究显示RNAi 过程中有新的dsRNA 分子的合成, 当siRNA 反义链识别并结合靶mRNA 后, siRNA 反义链可作为引物, 以靶mRNA 为模板在依赖于RNA 的RNA 聚合酶(RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的dsRNA , 然后由Dicer 切割产生新的siRNA , 新siRNA 再去识别新一组mRNA, 又产生新的siRNA, 经过若干次合成切割循环, 沉默信号就会不断放大(图1) 。正是这种称为靶序列指导的扩增(target2directed amplification) 机制赋予了RNAi 的高效性和持久性。

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RNA干扰技术的应用


基因功能研究
随着人类基因组计划的提前完成, 科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi 技术已成为解决这些问题的重要手段。与其他方法相比,RNAi 技术在基因功能研究上有其独特的优点:①简单易行, 容易开展; ②与基因敲除( geneknockout) 相比实验周期短, 成本低; ③与反义技术相比具有高度特异性和高效性; ④可进行高通量(high throughout) 基因功能分析。RNAi 技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法。随着后基因组学时代的到来,RNAi 技术将会成为功能基因组学研究的主要方法。

基因治疗
RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现,选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点,可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达,从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

RNA干扰的实现方法
目前实现RNAi主要有六种方法, 化学合成、体外酶法合成、长双链RNA消化、质粒载体介导的体内转录、PCR表达框介导的体内转录和病毒载体介导的体内转录。

化学合成
siRNA 可以直接进行化学合成, 方便且不受碱基限制, 但合成一个siRNA 需先分别合成两条单链(每条链合成需多步反应, 每步反应产物均需纯化) , 然后再退火成双链RNA , 合成耗时长且费用很高。在体外(in vit ro) 可用不同的方法将siRNA导入靶细胞, 一般来讲化学合成的siRNA 可用电转移(elect roporation) 、微注射和转染的方法引入细胞。向体内(in vivo) 导入siRNA 的研究工作也已有报道, 如有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA 引入动物体内进行基因功能的研究。但这些方法所产生的抑制效应都是很短暂的, 一般有效期只有一周左右。


体外酶法合成
此法需首先合成两段29nt 的DNA ,包括8 个与T7启动子3'端互补的碱基(称为引导序列,leadersequence) 和由21 个碱基构成的siRNA 编码序列。将这两段DNA 分别和T7 启动子混合, T7 启动子和DNA 引导序列退火结合, 然后用DNA 聚合酶Klenow 大片断补齐成为可用于转录的双链DNA 模板, 分别用T7 RNA 聚合酶进行体外转录, 再将产物混合形成dsRNA。新的双链RNA 包含5'端单链的引导序列和中间互补的19 个碱基序列以及3'端两个重复的U (UU) , 以DNA 酶降解模板,同时用单链专一的核糖核酸酶(RNase) 消化5'的引导序列, 由于RNase 不能切开U 碱基也不能降解双链RNA , 所以得到的产物就是所需的21bp的双链siRNA ---有19 对碱基互补, 3'端各有2个U 突出。导入靶细胞与化学合成的siRNA相同。

长双链RNA消化
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs的“混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长双链RNA( dsRNA ),然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法化学合成以及体外酶法转录的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,节省了时间和金钱,不过引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。

质粒载体介导的体内转录
质粒载体都包含有一个RNA 聚合酶Ⅲ ( PolⅢ) 启动子和一个4~5 个连续的T 构成的转录终止位点以及选择标记, 操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。常用的启动子包括熟知的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和反义链的模板, 正义与反义序列之间由一段环(loop) 序列隔开 , 插入载体Pol Ⅲ启动子下游, 然后转入细胞,环序列可使转录出的RNA 链折叠成具发夹结构的小RNA 分子, 这些小RNA 可被细胞内的Dicer 切割为长21bp 的siRNA ---有19 对互补碱基, 3'端各有2 个U 突出, 可引起特定基因沉默。构建的质粒载体带有抗生素标记和荧光标记,且相比除病毒载体外的方法,转染效率有很大的提高,因此具有干扰效率高、时间长等特点,因此得到了广泛应用。

PCR表达框介导的体内转录
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。改方法无需载体克隆、测序等步骤,可以直接由PCR得到,比较省时。但是由于PCR产物很难转染到细胞中,因此干扰效率很低。且使用此方法不能进行序列测定,PCR和DNA合成时有可能产生误读,因而导致结果不理想。。

病毒载体介导的体内转录
相比其他方法,病毒载体介导的体内转录具有转染效率高、基因沉默时间长等优点。对于某些无法用其他方法转染的细胞种类,应选用适合的病毒载体。选用特定的病毒种类如逆转录病毒为载体,还可以将干扰信息整合入基因组,达到传代的目的。