等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)

2015/11/18 3506

等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定的温度下,通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。常见的等温扩增技术有以下几种:

* 环介导核酸等温扩增技术(LAMP)

loop-mediated isothermal amplification , LAMP是2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物,利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30-60分钟,即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比,不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP 是一种全新的核酸扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点。

* 滚环扩增技术 RCA

滚环扩增技术(RCA)是近年来发展起来的一种新型的核酸扩增技术。该技术是基于连接酶连接、引物延伸、与链置换扩增反应的一种等温核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型探针互补的重复序列。与传统的核酸扩增方法相比,它具有扩增条件简单,特异性高,能在恒温条件下进行等特点。滚环扩增技术结合荧光、电化学、电化学发光等检测技术可以实现高灵敏的生物分子检测。

* 单引物等温扩增 SPIA

同一温度(42℃),在MMLV酶与一条引物的相互作用下,首先合成模板的互补DNA单链,互补DNA单链自身成环形成钥匙结构,并在MMLV酶的作用下形成T7 RNA聚合酶的启动子识别区域,T7 RNA聚合酶识别转录出多个RNA拷贝。每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环;同时,带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合,产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获,直观反映扩增循环情况。

* 依赖解旋酶的等温扩增技术 HDA

依赖解旋酶DNA 恒温扩增技术( Helicase-dependent Isothermal DNA Amplification, HDA)是由美国NEB公司研究人员V incent等于2004年发明的一种新型核酸恒温扩增技术。该技术模拟自然界生物体内DNA 复制的自然过程, 在恒温条件下利用解旋酶解开DNA双链, 同时DNA单链结合蛋白( single- stranded DNA - binding protein, SSB )稳定解开的单链, 并为引物提供结合模板, 然后由DNA 聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又解成单链, 并作为下一轮合成的模板进入上述的循环扩增反应, 最终实现靶序列的指数式增长。

* 链替代扩增 SDA

链置换扩增术(strand displacement amplification,SDA)是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列,核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口,DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行,使靶序列被高效扩增。

其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。

* 交叉引物扩增技术 CPA

 

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

1.LAMP引物的设计
LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域,基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
FIP(Forward Inner Primer):上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。
F3引物:上游外部引物(Forward Outer Primer),由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物:下游内部引物(Backward Inner Primer ),由B1C和B2区域组成,B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物:下游外部引物(Backward Outer Primer ),由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。


2.扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度,DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此,DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合(如图B所示),在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链(如图C所示)。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构(如图C所示)。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成,形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点.以自身为模板,进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板,FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成,解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点,以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换.形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA,BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB,它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成,周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

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3 LAMP的特点
LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点:
(1)操作简单,LAMP核酸扩增是在等温条件下进行,对于中小医院只需要水浴锅即可,产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT.LAMP),不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效,因为不需要预先的双链DNA热变性.避免了温度循环而造成
的时间损失.核酸扩增在l h内均可完成,添加环状引物后时间可以节省1/2,多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍,达0.5 mg/mL.应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性,由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
(4)高灵敏度,对于病毒扩增模板可达几个拷贝,比PCR高出数量级的差异。


缺点:由于LAMP扩增是链置换合成,靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作,以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。

4 引物设计实例
LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/),只要导入靶基因就能自动生成成组引物。
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程:
首先,单击浏览按钮选择靶基因序列文件,靶序列默认的是小于2 2 kbp。支持三个类型的文件,普通文本格式(仅含序列), FASTA格式和GenBank 格式文件。
第二,从下面三个选项中选择定参数设定(引物设计条件)条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的:如果GC含量小于或等于45%.,则选取AT丰度高的区,如果GC含量高于60%,则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。

设计合适的引物是进行LAMP反应的关键,通过考虑碱基组成,GC含量,二级结构的形成,Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计LAMP反应的引物。


  在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑:
1.引物之间的距离
  F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。 F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。 F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。
2.引物的Trn值
  引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算,这种方法是目前认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration),寡核苷酸的浓度等实验条件的影响,所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
  例如:寡核苷酸的浓度为0.1µmol,钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4 mM等。
  Tm(退火温度=△h*1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+] 式中,Tm为退火温度,℃;为摩尔气体常数,1. 987ca1/℃•rnol ; △H为焓变;△s 为熵变;C为寡聚核苷酸的浓度;[Na+]为钠离子浓度。
  对于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值为60~65℃,而对于AT富集的引物Tm值为}55~60℃。在设计引物的时候,F1c和B1c的Tm值大概是65℃(64~66℃), F2,B2, B31的Tm值大概是60℃(59~61℃)。
3.引物末端的稳定性
  引物的末端作为DNA合成的起点必须有一定的稳定性,自由能改变值(△G)是指反应物的自由能与产物的自由能之差,反应朝着自由能减小的方向运行口引物和目的基因之间的退火反应是一个动态平衡的反应,自由能改变值(△G)越小,引物与模板之间的退火反应越容易发生。
  一般在进行引物设计的时候,F2/B2F3/B3的3’端和F1 c/B1c的5’端的自由能改变值小于或等于-4Kcal/mol。F1C的5’端扩增以后相当于F1的3’端,所以它的稳定性很重要。
4 GC含量
  引物在设计的时候使其GC含量介于40%~65%之间,但是当引物的GC含量介于50%~60%时,引物的质量相对好一些。
5.二级结构
  引物在设计的时候要防止形成二级结构,这一点是十分重要的,特别是内引物。

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