RNase保护实验方法(RNase Protection Assay)

2014/10/25 admin 58

RNA酶保护法是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交,标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合,形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA,免受RNA酶的消化,故该方法命名为RNA酶保护实验。

目录

· 一、 RNA酶保护试验的介绍

· 二、试剂准备

· 三、操作步骤

· 四、电泳与放射自显影

· 五、注意事项

· 六、技术文档

RNA酶保护试验是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交,以检测RNA表达的技术。

一、 RNA酶保护试验的介绍

RNA酶保护试验(RNase Protection Assay,RPA) 是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交,以检测RNA表达的技术。与Northern blot和RT-PCR比较,RPA有以下几个优点:

1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失,使灵敏度下降,而RPA将所有杂交体系进行电泳,故损失小,提高了灵敏度。

2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题,基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降,而RPA没有扩增过程,因此,分析的数据真实性较高。

3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段,因此,部分降解的RNA样品仍可进行分析。

4.步骤较少,耗时短。与Northern杂交相比,省去了转膜和洗膜的过程。

5. RNA-RNA杂交体稳定性高,无探针自身复性问题,无须封闭。

6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交,无竞争性问题。

7. 检测分子长度可以任意设置,灵活性大。

RPA的缺点是需要同位素标记探针。

二、试剂准备

1. GACU POOL:取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl,加DEPC H2O至100μl。

2. 杂交缓冲液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA(pH8.0) 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml,加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化液:5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl.0.5M EDTA(pH8.0) 20μl.RNase A(10mg/ml) 8μl.RNase T1(250U/μl) 1μl,加DEPC H2O至2ml

三、操作步骤

(一) 反义RNA制备

可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子的PCR产物为模板制备,本文介绍后者。

1.设计含T7启动子的PCR引物

由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板,所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列: T7启动子序列为:5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度,具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR,即先扩增出一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性,如下图所示

2.PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR,再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR。

3.探针合成标记与纯化

在0.5ml 离心管中加入下列试剂:

RNasin (40U/μl) 0.5μl

GACU POOL GAC

(含GTP.CTP.ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl

DTT (二硫苏糖醇,0.1M) 1μl

5×转录 buffer 2μl

模板(50ng/μl) 1μl

T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

混合后,短暂离心,37℃保温1hr。

加入DNaseⅠ(10U/μl) 1μl, 37℃ 15min, 然后75 ℃ 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入:饱和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母tRNA(2μg/μl) 4μl

DEPC H2O 100μl

室温下充分混匀,离心10000g×2min。取上层液置另一0 .5ml离心管中,加入100μl氯仿,混匀,离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中,再加入3M NaAc 10μl,预冷无水乙醇250μl,混匀后,-20℃静置30min。4℃离心13500g×10min。弃上清液,沉淀用75%乙醇100μl洗涤,4℃离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀,4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。

(二) 杂交

1.RNA提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为1μg/μl。

2.取8μl RNA加入1-3μl探针(根据探针检测结果调整) 于0.5ml 离心管中。

3.80℃保温2min,然后40-45℃下杂交12-18hr。

(三) 消化

1.杂交管于37 ℃保温15min,加入RNase消化液,37 ℃保温30min。

2.加入10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白酶K 20μl,混匀,37 ℃保温10min。

3.加入65μl饱和酚和65μl氯仿,混匀,室温离心,10000g×2min。

4.转移上层液到另一0.5离心管中,加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl,再加入200μl异丙醇,混匀后,置-20℃ 30min,4 ℃离心,135000g×10min。

5.弃上清液,室温下挥发乙醇,加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
 

四、电泳与放射自显影

(一) 配制凝胶:(50ml)

40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:1) 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%过硫酸胺50μl,TEMED 50μl,混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。

(二) 预电泳(50ml)

以1×TBE为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达2000v以上,功率设定为100w,温度设为50 ℃。待胶板温度达50 ℃时,暂停电泳,准备加样。

(三) 加样

将已溶解在加样缓冲液中的样品80 ℃加热2min,立即加样到胶孔中,电泳1-2hr。(电泳条件同预电泳) 。

(四) 电泳结束

电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上一张X片,盖上暗盒,-70℃曝光1-3天。暴光结束后,将X光片显影.定影.水洗.晾干。

五、注意事项

1.本实验大部分为RNA操作,注意RNA酶的污染。

2.RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA,当探针与样品之间有碱基错配时,错配位点也将被消化,因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时,采取尽量减少错配的措施。

3.同位素对RNA合成有一定影响,有时会产生非全长的探针。因此,标记时间不宜过长。

4.RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号,可以将消化液稀释10-100倍后使用。