支原体检测服务

支原体是实验室中常见的污染细胞的原核生物(Table 1)。其环状双链DNA中富含腺嘌呤和胸腺嘧啶,细胞质中含有16S和23S核糖体RNA。细胞培养中的支原体污染会改变正常细胞的结构和功能。支原体能抑制细胞代谢和生长,改变核酸合成,影响细胞抗原性,导致染色体改变,干扰病毒复制以及模仿病毒的作用。支原体污染的小鼠胚胎干细胞会失去生殖系嵌合的能力。因支原体属于直径介于0.2-2µm的最小原核生物,形态易变,故极易通过滤膜而逃过培养液的过滤除菌步骤。又因其缺少细胞壁,所以对某些常用抗生素具有抗性。在细胞培养液中,支原体可达到107-108CFU/mL(CFU=Colony Forming Unit,是一种支原体的浓度测量单位)而不使培养液混浊及影响细胞生长。多种支原体对细胞不产生任何病变效应,使得细胞污染不易被察觉。

华泰昕

 

附:支原体检测方法
DNA染色:
1.将两片盖玻片放到60×15mm玻璃培养皿中,121℃湿热灭菌20分钟。
2.向每个培养皿中加入3ml DMEM。确认盖玻片是浸没在培养液中而不是漂在液面上。
3.用上述培液将非洲绿猴肾细胞系Vero制成1.0×104细胞/ml的单细胞悬液。
4.向每个培养皿中接种细胞悬浮液。
5.在37℃、5%CO2-95%空气培养箱中培养过夜。
6.显微镜下观察细胞是否已贴在盖玻片上。在每个培养皿盖上编号以标记接种样品。
7.向阴性对照培养皿中各加入100μl培养液。
8.向样品培养皿中各加入100μl的样品(接近长满并且三天之内没有换液的细胞培养物。其上清液可做为样品)。
9.向阳性对照培养皿中加入100μl B6yH4上清液(已知支原体阳性)。
10.将培养物重新放回CO2培养箱中培养4天。
11.盖玻片的固定、染色和封存
a.取出盖片,用D-Hanks液漂洗,以固定液(乙酸:甲醇=1:3)固定两次,分别为5分钟和10分钟。
b.吸出固定液,让培养物风干。
c.用Hoechst 33258染液染色30分钟。
d.干燥后封片。


培养法:
1.选择接近长满并且三天之内没有换液的细胞培养物。
2.取出3-5ml培养液做为样品。
3.用一次性无菌刮片刮下一部分单层细胞放到剩下的培养液中。
4.将待检细胞上清液接种到支原体肉汤培养物中,pH6.5和pH7.6的肉汤各0.3-0.5ml。
5.于37℃下需氧条件培养肉汤培养物4天以上,观察pH变化以判定污染情况。