一步法总RNA提取试剂

2013/12/20 admin 296

一步法总RNA提取试剂:

 

货号 规格 单价(1-5瓶) 单价(6-10瓶) 单价(≥11瓶)
17061 100ml 420 350 280

 


 

 

RNA纯化技术背景:

    RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分,不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示(mRNAdifferential display)、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交(suppression Subtraction Hybridization, SSH)、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA。 因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题。     RNA提取的第一步是细胞裂解,这一步简而言之就是要使组成细胞膜的蛋白变性。1979年John Chirgwin和他的同事发明了一种可以不改变核苷酸而破裂细胞膜的方法:
     先将组织在异硫氰酸胍Guanidine Thiocyanate(一种蛋白变性剂)和b-巯基乙醇(一种还原剂)中混合均匀(胍基裂解法),然后通过乙醇抽提或者氯化铯梯度超速离心就可以分离纯化细胞中的RNA了。这种技术是第一种可以特异性分离RNA的方法,但是存在许多缺点,比如这种技术耗时长,低效率,也存在一定的危险性和不一致性。
     1987年彼得亚雷(Piotr)Chomczynski对这一技术进行了改良,他通过将异硫氰酸胍和酚/氯仿(phenol-chloroform)结合起来,将抽提的步骤缩短到了一步,这一修改至少带来了两个改进:
      第一,减少了RNA分离的时间,增加收集到的样品数;
      第二,就是减少了RNA的损失,增大了样品选择范围,允许研究人员从更少量样品数中纯化RNA。
      然而尽管优化了纯化步骤,但是这种方法仍然有一些不足之处,比如说,超速离心不仅需要昂贵的设施,而且也经常导致RNA凝集,形成pellets,不利于悬浮。而且粗糙的有机溶剂也会引起样品中RNA断裂,造成损失。
      彼得亚雷Chomczynski请他的朋友尼可莱塔萨基(Nicoletta Sacchi)来评估这一方法,他们称之为单步总RNA提取方法,即酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC).由于总RNA提取(Total RNA Isolation)-TRI是异硫氰酸胍-酚-氯仿(guanidinium-phenol-chloroform)(guanidine thiocyanate-phenyl-chloroform)三种试剂的组合,因此他们命名为TRI Reagent(三试剂),并当年在美国分析生物化学上出版了这一方法的论文,距美国Thomson ISI统计近20年间(1983至2002)他们的这篇论文在科学界被引用了40000多次. 

 

排名

作者姓名

所属机构

领域

论文

被引次数

17

Piotr Chomczynski

Molecular Res. Ctr.

Biology & Biochemistry

34

49,794

18

Nicoletta Sacchi

U. Milan

Biology & Biochemistry

99

48,685

 

彼得亚雷Chomczynski于1942年11月6日出生于波兰华沙,1971年获得博士学位,1983年来到美国,后来成为一位分子生物学家(Molecular biologist),生物化学家(biochemist),担任分子研究中心MRC(Molecular Res. Ctr.)实验室主席,于1989年成立分子研究中心公司(Molecular Research Center, Inc.)www.mrcgene.com,并将TRI Reagent(三试剂)单步总RNA提取方法审请了美国专利4843155和世界专利5346994,注册商标为TRIzol®.后来把专利卖给了invitrogen/Gibco,invitrogen/Gibco将此方法推广到世界。
     MRC的trizol曾经由其他公司OEM(委托加工)制作,现在已经自己生产.本来Trizol是一个专利的品牌,但是世界上也有不少仿制的品牌,基本的原理是一样,配方稍有不同。

TRIzol® was used to isolate total RNA

1.大鼠肾脏
2.P0 cells
3.leafy sprouts
4.人体血液

 

RNA提取方法:

     TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。

综述  
     对任何一种RNA提取方式的评价,首先要评价该方法是否能获得高纯度完整的RNA,这是评价一种方法有效性的根本指标。实验结果表明,以一步法为基础建立的RNA快速提取一步法能够获得高纯度完整的RNA,其效果优于传统的一步法,与目前市售的进口试剂盒的效果基本一致。
     完整的RNA取决于最大限度地避免提取纯化过程中内源及外源性的核糖核酸酶(RNA酶)对RNA的降解。采用高活性的RNA酶抑制剂是防止RNA降解的有效方法。异硫氰酸胍是已知作用最强的蛋白变性剂,它在裂解细胞释放RNA的同时能迅速使RNA酶失活,避免RNA被降解。酸性环境有利于胍盐活性的发挥,能最大限度地发挥其对RNA酶的抑制作用;十二烷基肌氨酸钠和酚是强的蛋白变性剂,对RNA酶也有一定的抑制作用,使细胞裂解产生的各种蛋白迅速变性。酸性环境下RNA、蛋白质和DNA分别进入不同的分布相中,RNA进入上层水相,蛋白质进入下层有机相,DNA则进入位于上下两层界面处的中间层。氯仿不但有一定的蛋白变性作用,而且能迅速使各相分离,使RNA与其它成份分开。因此,由上述成份组成的RNA快速提取试剂构成获得高纯度完整RNA的基础。
     按传统的一步法提取RNA,所用各种试剂需要分别加入,操作环节多,这将增加外源RNA酶污染RNA使其降解的机会,从而增加了操作难度。RNA快速提取试剂则把多种所需试剂,组合在一个溶液体系中,使组织破碎和抽提只需加一次试剂代替了传统方法多次加入试剂,这不但使操作简化,而且减少了外源RNA酶污染的机会。RNA快速提取试剂的另一特点是把多种成份组合在一起,较各成份单独存放更加稳定,能够长期保存。另外,RNA快速提取方法简化了传统一步法的操作程序,去掉了变性液复溶和异丙醇再次沉淀的步骤,这不但使操作简化,而且使RNA丢失减少,回收率增加,同时使RNA的提取周期由原来的4 h缩短至1 h,这不但节省了时间,提高了工作效率,而且减少了RNA降解的机会。
     匀浆方式是影响从组织提取高纯度完整RNA的重要因素。

    在进一步完善这些方法的道路上,许多生物技术公司也贡献不小,比如著名的RNA公司Ambion(现RNA部门已被ABI收购),旗下的ToTALLY RNATM总RNA提取试剂盒就是基于Chomczynski和Sacchi的异硫氰酸胍,酚:氯仿方法,这个试剂盒包含了这一方法所需的除异丙醇以外的所有试剂。通过Ambion的试剂整合和流水线操作,ToTALLY RNATM试剂盒可以从来源广泛(包括植物组织到细菌在内的许多来源),样品量较低(10g组织或者109培养细胞)的条件下纯化得到高质量RNA。
    另外一个倍受关注的,改进了RNA分离提取方法的生物技术公司就是GE(原Amersham Biosciences)公司了,虽然GE采用的也是异硫氰酸胍方法,吸取了其中的优点,但是他们的RNA提取试剂盒利用氯化锂和三氟醋酸铯(cesium trifluoroacetate,CsTFA)进行选择性沉淀和密度离心,这样就不用依赖于有机溶剂,可以用普通的离心机在60分钟内,从少至25mg或者106-108细胞样品中分离得到RNA,而且CsTFA离心对于避免RNAses降解作用也有更高的保护作用。
    近期GE又推出了一款新产品:RNAspin总RNA分离试剂盒,这一系列试剂盒采用了最新的硅胶膜离心柱,配合独有的预过滤器和柱上  DNaseI 酶解等技术, 能确保每次实验都能得到所需要的产率、纯度和重复性,这一试剂盒就像是特别为敏感的下游应用,例如定量RT-PCR 及微阵列分析而设计的一个RNA纯化分离试剂盒。
    除此之外,Maxim Biotech则提供了一种能从任何组织或者细胞类型的样品中提取RNA的试剂盒:GstractTM总RNA分离试剂盒,这一试剂盒有一个独特的附加提取步骤,能减少DNA和其它污染物的含量,因此得到的RNA可以直接用于一些譬如RT-PCR的实验。